Endocytose et voie de signalisation Notch Endocytosis and Notch signalling

Depuis C. elegans jusqu’aux vertébrés supérieurs, la voie de signalisation Notch contrôle la compétence de multiples types cellulaires à se différencier. L’activation du récepteur transmembranaire Notch (un gène chez la drosophile, 4 chez les mammifères) est déclenchée par son interaction avec un ligand transmembranaire de la famille DSL (Delta ou Serrate chez la drosophile, Delta 1, 3, 4, ou Jagged 1, 2 chez les mammifères) présenté par une cellule voisine. Le récepteur subit alors deux coupures protéolytiques successives, dans son domaine extracellulaire par une protéase de la famille ADAM (a disintegrin and metalloprotease), puis au sein du domaine transmembranaire par un complexe multiprotéique, la γ-sécrétase (Figure 1). Le domaine intracellulaire du récepteur est ainsi libéré dans le cytoplasme et migre dans le noyau, où il interagit avec la protéine CSL (CBF1, aussi appelé RBP-Jκ chez les vertébrés, Su(H) chez la drosophile, et Lag-1 chez C. elegans) pour reconstituer un activateur transcriptionnel. Les ligands comme les récepteurs sont soumis à des processus comparables de clivages protéolytiques successifs et d’endocytose, sans que, concernant les ligands, leurs rôles soient encore bien compris. L’importance de l’endocytose des ligands et du récepteur Notch pour la signalisation a été initialement décrite chez la drosophile [1] grâce à l’utilisation de mutants pour la dynamine, et fait l’objet de nombreux travaux récents.

Figure 1

Schéma simplifié de la voie de signalisation Notch.

Pendant la maturation de la protéine, Notch subit un premier clivage par la furine (S1). Après l’interaction avec son ligand, ici Delta, Notch subit un second clivage (S2) par une métalloprotéase TACE. Le domaine extracellulaire (NECD) du récepteur Notch est relargué, et le fragment tronqué du domaine extracellulaire restant devient le substrat du complexe γ-sécrétase qui libère le fragment intracellulaire du récepteur (NICD). Celui-ci migre dans le noyau où il forme un complexe activateur de la transcription avec CSL et MAM (mastermind) qui active les gènes cible de la famille hes/hey (hairy enhancer of split) (d’après [13]).

Endocytose du récepteur Notch

L’endocytose du récepteur Notch est nécessaire pour le maintien d’une quantité fixe de récepteurs activables à la membrane, en ciblant et accompagnant les molécules surnuméraires ou défectueuses vers la dégradation, mais elle intervient aussi après activation du récepteur pour le diriger vers le compartiment où peut agir la γ-sécrétase. Nous avons montré que le récepteur Notch, après activation, doit être internalisé et mono-ubiquitinylé pour être clivé par la γ-sécrétase [2]. Chez la drosophile, Sanpodo, une molécule à 4 domaines transmembranaires, joue probablement un rôle positif dans l’activation de Notch en régulant son internalisation de façon antagoniste à Numb [3].

Lorsqu’il n’est pas activé, le récepteur Notch est internalisé et transporté dans des vésicules d’endocytose jusqu’aux lysosomes. Une des premières étapes de ce voyage est l’ubiquitinylation de Notch. Ce signal encore mal caractérisé lui permet probablement d’être trié par interaction avec Hrs/Vps27, puis dirigé vers les vésicules contenant les complexes ESCRT-I (endosomal sorting complex required for transport) puis ESCRT-II et ESCRT-III. Les protéines sont alors invaginées dans des petites vésicules au sein des MVB (corps multivésiculaires) et finalement dégradées après fusion des MVB avec les lysosomes. Chez la drosophile, des mutants pour plusieurs des molécules impliquées dans ces trafics bloquent effectivement la dégradation du récepteur, ce qui explique qu’ils provoquent une augmentation de l’activité Notch. C’est le cas pour Vps25, Vps22, et Vps32 [4, 5]. En revanche, si les voies d’endocytose sont bloquées plus en amont, par diminution de Hrs, Avl (homologue des syntaxines 7 ou 12, localisé dans les endosomes précoces) ou Rab5, Notch s’accumule à la surface cellulaire mais son activité globale n’augmente pas [6]. Ces résultats sont compatibles avec l’idée selon laquelle le récepteur, qu’il soit activé par liaison du ligand ou pas, subit le processus d'endocytose par une voie dépendant de Rab5 et Avl, et qu’une étape de tri a alors lieu. Selon l’état d’ubiquitinylation du récepteur ou son association avec certaines molécules, il pourrait alors poursuivre sa route vers l’activation ou la dégradation. L’étude des ubiquitinylations subies par le récepteur, et des E3 ubiquitine ligases spécifiques de chacune d’entre elles permettra d’élucider ces phénomènes. L’ubiquitinylation par Nedd4 ou Itch/Su(Dx) et cbl pourrait permettre au récepteur d’être dégradé, tandis que son unique mono-ubiquitinylation lui serait nécessaire pour être reconnu par le complexe γ-sécrétase et donc activer ses gènes cibles.

Endocytose des ligands

Des études génétiques menées chez la drosophile et le poisson zèbre ont montré qu’un certain nombre de gènes régulaient l’activité des ligands [7]. Ils agissent sur l’endocytose des ligands et sont indispensables à l’activation du récepteur porté par une cellule voisine. Neuralized et Mind bomb, deux E3 ubiquitine ligases, sont conservées chez les mammifères, et ont des fonctions partiellement redondantes qui permettent le recrutement des ligands et le transfert de l’ubiquitine sur ces derniers. De telles modifications sont nécessaires pour l’internalisation des ligands : en l’absence de ces enzymes, les ligands s’accumulent à la surface de la cellule. Cette endocytose de Delta a lieu en l’absence de toute interaction entre le récepteur et le ligand [8]. Le trafic du ligand Delta et donc son activité de signalisation peuvent êtres abolis par un antagoniste de Neuralized, appartenant à la famille des protéines Bearded [9, 10]. Lqf, homologue de l’epsine de mammifère, joue un rôle dans le recrutement d’AP-2 et la formation des puits recouverts de clathrine. Elle ciblerait, via son domaine d’interaction avec l’ubiquitine, les ligands mono-ubiquitinylés vers certains compartiments d’endocytose. La quantité disponible de Lqf est contrôlée par Fat Facets (Faf), qui empêche la dégradation de Lqf en catalysant sa désubiquitinylation [11]. Chez la drosophile, Rab11 et son effecteur Sec15, ce dernier initialement identifié comme composant des vésicules d’exocytose, sont également requis pour le recyclage et l’activité du ligand Delta [12].

Plusieurs modèles ont été proposés pour expliquer comment l’endocytose des ligands et leur trafic dans la cellule émettrice du signal étaient nécessaires à l’activation du récepteur dans la cellule voisine [13] (Figure 2).

1. La trans-endocytose de la région extracellulaire du récepteur associée au ligand serait une étape nécessaire au clivage activateur (S2) du récepteur (Figure 2A).

2. Lors de l’endocytose et du recyclage vers la membrane, les ligands subiraient des modifications, ou s’associeraient à des cofacteurs, les rendant plus affins pour le récepteur (Figure 2B).

3. Le recyclage ciblerait les ligands vers des microdomaines membranaires où, en association avec des cofacteurs, ils pourraient se regrouper et établir des liaisons plus fortes avec les récepteurs eux-mêmes agglutinés sur la cellule voisine (Figure 2B).

4. Les ligands internalisés et regroupés dans les MVB seraient libérés dans le milieu extracellulaire sous la forme d’exosomes (Figure 2C).

Figure 2

Différents modèles proposés pour le rôle de l’endocytose de Delta dans le fonctionnement de la signalisation Notch.

A. L’endocytose de Delta facilite le second clivage (S2) du récepteur Notch. B-D. L’endocytose de Delta et son recyclage résulte en une présentation des molécules Delta plus efficace. B. Le recyclage de Delta entraîne son regroupement avec d’autres molécules ainsi qu’avec des cofacteurs et sa localisation dans un microdomaine, ou sa modification (étoile rouge) dans le domaine extracellulaire facilitant son interaction avec le récepteur Notch. C. Après son endocytose, les ligands Delta sont internalisés dans des corps mutivésiculaires (MVB), et via des exosomes, relarguent plusieurs molécules Delta groupées (d’après [13]).

Les modèles proposés expliquent comment l’endocytose des ligands est nécessaire à l’activation du récepteur en trans. Les ligands du récepteur Notch ayant une ou des fonction(s), dans la cellule où ils sont exprimés, autre(s) que celle d’activer le récepteur, il reste à étudier le lien entre les processus d’endocytose et ces fonctions (adhérence, mobilité, signalisation…). La recherche de partenaires du ligand Delta a abouti à la caractérisation de protéines appartenant à la famille des protéines à domaines PDZ [14, 15] dont on ne sait pas encore si elles jouent un rôle dans le trafic de Delta.

Tableau I

Conservation et rôles des facteurs impliqués dans le trafic de Notch et de ses ligands.

Drosophile	Mammifères	Fonctions
Régulateurs positifs de la voie Notch, jouant sur les ligands
Mib1	Mind bomb	Ubiquitinylation et endocytose des ligands
Mib2	Skeletrophine
neuralized	Neuralized 1,2
Liquid facets (Lqf)	Epsine
Fat facets (Faf)	Fat facets in mouse (FAM)	Désubiquitinylation de Lqf/ epsine
Sec15	Sec15	Régulation du trafic de Delta, Notch et Sanpodo en association avec Rab11
Rab11	Rab11	Régulation et activation de Delta par endocytose-recyclage
Régulateurs négatifs de la voie Notch, jouant sur les ligands
Famille Bearded	?	Inhibition de neuralized
Régulateurs positifs de la voie Notch, jouant sur le récepteur
Deltex	Deltex 1-4	Ubiquitinylation et endocytose du récepteur
Sanpodo	Pas d’orthologue	Interaction avec Notch et numb
Avalanche	Syntaxines 7 ou 12	Endocytose précoce du récepteur
Rab5	Rab5
Hrs	Hrs
Régulateurs négatifs de la voie Notch, jouant sur le récepteur
Su(dx)	Itch/AIP4	Ubiquitinylation et endocytose du récepteur
Nedd4	Nedd4
Numb	Numb	Interaction avec Notch, Sanpodo et α-adaptine
Erupted	Vps23/Tsg101	Composant ESCRT-I
Vps22, Vps25	Vps22, Vps25	Composant ESCRT-II
Vps32	Vps32/Snf7	Composant ESCRT-III
Krz	β-arrestines 1, 2	Interaction avec Deltex, Notch