Comment localiser un gène morbide sans étude de liaison génétique? Cell complementation as an alternative to analysis of genetic linkage to identify altered genes

Cette question se pose de plus en plus souvent pour les maladies génétiques dites orphelines car les études de liaison génétique sont souvent très limitées ou impossibles du fait de la petite taille des familles ou de l’hétérogénéité génétique. C’est le cas des maladies mitochondriales, qui, bien que relativement fréquentes (1/10000 naissances environ) [1], sont extrêmement hétérogènes tant sur le plan clinique que génétique. On ne connaît pas encore tous les gènes codant pour des protéines mitochondriales chez l’homme, mais on peut estimer qu’il en existe plusieurs centaines. On ne s’étonne donc pas alors de rencontrer des maladies mitochondriales dues à des gènes « privés » [2]. Cette caractéristique rend l’identification des gènes responsables de ces maladies par liaison génétique extrêmement difficile et réalisable uniquement dans les familles de grande taille. Pour contourner cette difficulté, le groupe d’A. Munnich a élaboré une approche de complémentation fonctionnelle par transfert de chromosome [3]. Le principe de cette approche est d’introduire, dans des cellules issues de patients et mises en culture, en l’occurrence des fibroblastes, les différents chromosomes humains et d’observer les conséquences de ce transfert sur le phénotype des cellules. Les chromosomes humains sont porteurs d’un gène de sélection, le plus souvent codant pour une protéine de résistance à un antibiotique. Une correction du déficit enzymatique de la chaîne respiratoire dans les clones obtenus montrera que le chromosome introduit porte le gène qui est muté chez le patient. Les chromosomes humains sont obtenus par fragmentation de cellules hybrides stables homme-rongeur ne contenant qu’un seul chromosome humain. Les microcells contenant ce chromosome sont ensuite fusionnées avec les fibroblastes de patients présentant un déficit de la chaîne respiratoire (Figure 1). Cette technique n’avait été utilisée auparavant qu’une seule fois avec succès dans le domaine des maladies mitochondriales [4] et a été très améliorée par l’utilisation d’un milieu sélectif dans lequel les cellules déficitaires meurent en quelques jours ((→) m/s 1999, n° 3, p. 409). Ce milieu, dépourvu de sucres, impose aux cellules de ne vivre que sur ce qui est produit par leur chaîne respiratoire et permet une discrimination rapide de l’efficacité de la complémentation sur la fonction mitochondriale. Ainsi, seules survivront les cellules qui auront intégré le chromosome normal portant le gène dont l’anomalie est, dans les cellules du patient, responsable du déficit, sans qu’il y ait besoin d’appliquer une sélection par un antibiotique. La seule présence d’un clone permet d’identifier le chromosome en cause et l’étude biochimique de ce clone ne fait que confirmer qu’il y a bien eu correction du déficit. Une fois qu’un chromosome a été identifié, on est malheureusement encore assez loin d’avoir trouvé le gène responsable de la maladie. Les lignées Genebridge 4 (GB4) du Généthon, qui ont permis le séquençage du génome humain, ont ensuite été utilisées pour identifier de petites régions chromosomiques. Le panel GB4 est constitué de 93 lignées homme-rongeur qui sont des hybrides d’irradiation, chacune contenant environ un tiers du génome humain [5]. Pour chaque patient, une vingtaine de ces lignées a été utilisée. Dans chaque analyse, ces lignées ont été fragmentées pour donner des microcells contenant des morceaux de chromosomes humains, et ces fragments ont été ensuite fusionnés avec les fibroblastes des patients. Là encore, l’utilisation du même milieu sans sucres permet une sélection directe des cellules dans lesquelles une chaîne respiratoire fonctionnelle a été restaurée. La comparaison du contenu génétique des différentes lignées qui ont survécu et abouti à la production d’un clone permet alors de définir la région commune minimale qui contient le gène en cause. Si cette approche de complémentation fonctionnelle par transfert de chromosome ou de …