Nouvelles stratégies d’obtention des cellules souches embryonnaires Derivation of embryonic stem cells

Les cellules souches embryonnaires (CSE) sont des cellules indifférenciées, qui prolifèrent in vitro, et ont le potentiel de se différencier dans tous les types cellulaires de l’organisme, suscitant, à ce titre, un intérêt thérapeutique. Les CSE sont dérivées de la masse cellulaire interne de blastocystes, nécessitant la destruction de ces derniers [1]. De ce fait, l’utilisation de lignées de CSE humaines existantes, et la production de nouvelles lignées chez l’homme sont soumises à une réglementation stricte ((→) m/s2003, n° 6-7, p. 683) et se heurtent à certaines oppositions. Des études récentes tentent de répondre à ces limitations en proposant des stratégies d’obtention de CSE sans destruction des embryons.

Y. Chung et al. rapportent l’établissement, chez la souris, de lignées de CSE à partir de blastomères - stade du développement où l’oeuf ne comporte que 8 cellules - sans affecter la poursuite du développement des embryons [2]. Les lignées sont établies à partir d’un seul blastomère, tandis que les embryons ne comportant plus que 7 cellules se développent normalement après implantation dans l’utérus. L’établissement de ces lignées nécessite l’agrégation des blastomères avec des CSE préexistantes. Ces dernières sont marquées avec la GFP (green fluorescent protein), ce qui permet de les distinguer des cellules issues du blastomère (exprimant lacz). En l’absence d’un tel support cellulaire, les blastomères ne se divisent pas et se différencient. Après 2 à 4 jours en culture, les cellules dérivées de blastomères (non marquées à la GFP) se sont divisées et sont alors séparées des CSE fluorescentes, et cultivées selon les mêmes protocoles que les CSE. L’absence de contamination par les CSE « nourricières » est attestée par l’absence de transcrits codant pour la GFP, et par l’absence de fusion cellulaire. Les auteurs ont ainsi établi cinq lignées cellulaires de CSE qui possèdent les caractéristiques habituelles : pluripotentialité et capacité à former des tératomes chez la souris. En particulier, après injection dans des blastocystes, elles participent à la formation de tous les tissus chez l’hôte, y compris les lignées germinales. Elles expriment également des marqueurs des CSE (Oct-4, SSEA-1). Des lignées trophoblastiques ont pu également être établies en cultivant les CSE en présence d’un facteur trophique, le FGF-4. Ces résultats démontrent que des cellules isolées de blastomères peuvent être utilisées pour dériver des lignées de CSE, une approche qui n’interfère pas avec le potentiel de développement de l’embryon. L’efficacité est cependant faible, puisque seules 12 lignées de CSE ont été dérivées à partir de 125 blastomères, alors que le taux d’efficacité est de 25 %-30 % à partir de blastocystes.

Dans le cas du transfert nucléaire, et sans revenir sur le scandale récent de l’équipe coréénne dont la revue s’est faite l’écho ((→) m/s2006, n° 2, p. 218), certaines des réticences et craintes concernaient la « création » artificielle d’un « embryon », sa destruction et la dérive potentielle vers un clonage reproductif. Le transfert nucléaire consiste à isoler des noyaux de cellules somatiques, par exemple de fibroblastes, et à les introduire dans des ovocytes anucléés. Par des mécanismes inconnus, le cytoplasme des ovocytes reprogramme les chromosomes des noyaux des cellules somatiques, et l’oeuf peut poursuivre son développement jusqu’au stade blastocyste, à partir duquel des lignées de CSE isogéniques peuvent être développées [3]. Afin de prévenir tout risque de développement de type « reproductif », W. Hurlbut propose une technique de « transfert nucléaire altéré » (TNA) [4]. Le concept du TNA repose sur l’inactivation d’un gène essentiel pour le développement du trophectoderme, comme le gène Cdx2 [5], ce qui empêche la formation de la barrière foeto-maternelle. Le TNA produit des blastocystes incapables de s’implanter dans la paroi utérine, alors que leurs masses cellulaires internes sont intactes.

A. Meissner et R. Jaenisch ont récemment décrit un protocole pour dériver des lignées de CSE par TNA, chez la souris [6]. Les auteurs ont modifié génétiquement des fibroblastes de la peau, en insérant dans le génome, via un vecteur lentiviral, une cassette codant pour un ARN cdx2 interférant et pour la GFP, flanquée de deux séquences LoxP. L’ARNi-Cdx2, la GFP, les séquences LoxP permettent respectivement l’inhibition du transcrit Cdx2, la sélection des fibroblastes transduits, et l’excision de la cassette ARNi-cdx2 -GFPin situ, au moyen de la Cre-recombinase. Les noyaux des fibroblastes ainsi modifiés ont été transférés dans des ovocytes anucléés. A. Meissner et R. Jaenisch ont alors dérivé des lignées de CSE à partir des blastocystes résultant de cette manipulation (61 blastocystes sur 526 ovocytes, et 14 % des blastocystes donnent des lignées ES). Ils ont également confirmé que ces derniers ne s’implantent pas dans la paroi utérine, et ne forment pas de trophectoderme in vitro. Les CSE dérivées de ces blastocystes sont pluripotentes et, après leur implantation dans des blastocystes normaux, participent aux tissus des souriceaux nouveau-nés chimériques (à l’exception de l’intestin). Mais ces CSE sont incapables d’engendrer des blastocystes tétraploïdes lors d’expérience de fusion. Il est donc probable que le rôle du facteur de transcription Cdx2 ne se limite pas à la formation du trophectoderme, mais participe au développement de l’individu. Il est donc nécessaire de rétablir l’expression de Cdx2, afin de ne pas compromettre le potentiel des CSE dans lesquelles la protéine cdx2 n’est pas produite. Pour cela, la délétion de la cassette ARNi-Cdx2 est effectuée par la transfection d’un plasmide codant pour la Cre-recombinase, ce qui rétablit un potentiel de développement normal aux cellules ES. La pluripotentialité des CSE après action de la Cre-recombinase ne peut pas être confirmée in vivo, les cellules n’exprimant plus la GFP. Les auteurs ont ainsi démontré que les blastocystes déficients pour Cdx2 ne forment pas de trophectoderme fonctionnel et ne s’implantent pas dans la paroi utérine. Les CSE issues de ces clones conservent leur pluripotentialité, mais ne peuvent contribuer à un développement normal chez l’individu, du fait de la perte de l’activité de Cdx2. En revanche, après rétablissement de Cdx2, les CSE retrouvent leur potentiel. Ce travail démontre donc qu’il est possible d’inhiber la formation des annexes placentaires sans altérer la pluripotence de CSE. Sans minimiser la prouesse technique, R. Jaenisch souligne lui-même en conclusion que cette approche n’a pas d’application chez l’homme : elle ne répond pas au débat lié à la destruction de l’embryon, car avant l’expression de cdx2, l’embryon n’est pas fondamentalement anormal. D’autre part, nous ignorons tout du rôle de cdx2 au cours du développement embryonnaire chez l’homme, et les nombreuses manipulations requises par l’extinction de cdx2 et sa réexpression posent en elles-mêmes des problèmes éthiques difficiles. Quant à la technique proposée par Y. Chung, bien que l’isolement de blastomères soit pratiqué pour le diagnostic génétique préimplantatoire (DPI) dans les familles où il existe un risque de maladie génétique grave, leur capacité à établir des CSE n’est pas connue, et une telle démarche soulèverait aussi de très nombreuses questions [7-9].

Figure 1

Différentes stratégies permettant d’obtenir des lignées de cellules ES pluripotentes.

1. Stratégie classique d’obtention de cellules ES à partir de la masse interne d’un blastocyste provenant des divisions d’un oeuf fécondé. Il y a destruction du blastocyste (ce que symbolise le « OU »). 2. Obtention de cellules ES à partir d’un blastomère unique prélévé au stade 8 cellules [2]. Cette stratégie permet l’obtention de cellules ES sans détruire le blastocyste (ce que symbolise le « ET »). 3. Obtention de cellules ES par transfert du noyau d’une cellule somatique dans un ovocyte énucléé. 4. Obtention de cellules ES par transfert d’un noyau modifié génétiquement de façon à rendre impossible l’implantation du blastocyste dans la membrane utérine et son développement normal [6] (adapté de [7]).