Dynamique d’assemblage des machineries nucléolaires après la mitose, en temps réel et en cellules vivantes Tracking the interactions of rRNA processing proteins during nucleolar assembly in living cells

Le noyau des cellules est réorganisé après chaque mitose. Ce qui implique la reformation de l’enveloppe nucléaire, la décondensation de la chromatine et la réorganisation des machineries nucléaires. Il faut réadresser les machineries au bon endroit au bon moment pour rassembler un noyau fonctionnel. La re-formation du nucléole, site de la biogenèse des ribosomes, a été choisi comme système modèle [1, 2]. Nous cherchons à comprendre comment les machineries de maturation des ARN ribosomiques (ARNr) sont recrutées sur les sites de transcription des gènes ribosomiques. Pendant la mitose, les machineries de maturation nucléolaires sont localisées à la périphérie des chromosomes et donc à distance des gènes ribosomiques. On sait que le recrutement des protéines de maturation n’est pas direct mais fait intervenir une étape intermédiaire : la formation de corps appelés PNB (prenucleolar body) [3-5]. Dans un travail récent, nous avons comparé la dynamique de formation des PNB, le tri des protéines en fonction du temps et les interactions protéines-protéines dans les PNB [6]. Notre but est de comprendre le rôle des PNB au cours de l’assemblage du nucléole. Nous avons utilisé la vidéo microscopie pour comparer la dynamique des protéines avec des étiquettes fluorescentes vertes (GFP) ou rouge (DsRed). Nous avons comparé les concentrations des protéines de maturation précoces ou tardives dans les PNB. Enfin nous avons utilisé une méthode de FRET (fluorescence resonance energy transfer) fondé sur la décroissance de la durée de vie de la GFP (donneur) en présence de DsRed (accepteur) [7]. Cette analyse non invasive, est réalisée pendant l’assemblage du nucléole et mesure la distance entre les deux étiquettes fluorescentes. La distance entre la GFP et la DsRed est inférieure à 7 nm s’il y a FRET ce qui correspond à la distance d’interaction des molécules. Les protéines de maturation précoce (fibrillarine) et de maturation tardive (Bop1, B23 et Nop52) sont co-localisées en anaphase à la surface des chromosomes et forment plusieurs dizaines de PNB par noyaux en télophase. Nous avions montré préalablement en vidéomicroscopie [8] que la présence de la fibrillarine dans les PNB était en moyenne de 15 minutes avant son recrutement dans le nucléole, tandis qu’elle était de 80 minutes pour Nop52. Nous en avions conclu qu’il y avait deux types de PNB correspondant respectivement à la maturation précoce et à la maturation tardive et à la cinétique de recrutement des protéines dans le nucléole. Dans ce travail, nous avons comparé dans la même cellule la dynamique des deux types de protéines. Nous avons co-exprimé la GFP-fibrillarine et la DsRed-B23, et suivi la localisation respective des deux protéines. Les images montrent la superposition des deux signaux dans les mêmes PNB. La quantification des deux signaux dans les PNB et en dehors des PNB indique : (1) que les deux protéines passent par les mêmes PNB ; (2) que la concentration dans les PNB est de 3 à 6 fois celle des protéines diffuses ; et (3) que la fibrillarine quitte plus vite les PNB que la protéine B23. Ainsi, dans les PNB, des protéines des machineries de maturation précoce et tardive sont co-localisées, mais leur temps de résidence n’est pas le même. Il y a donc un mécanisme de tri pour adresser ces protéines dans le nucléole. La même démarche a été suivie pour comparer la dynamique des protéines tardives entre elles. Nous avons constaté que les protéines Nop52 et B23 étaient ensemble dans les PNB et que leur concentration variaient simultanément dans les PNB et dans le nucléole. Cette observation peut s’expliquer par une interaction entre ces deux protéines avant leur recrutement dans le nucléole. Pour mettre …