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1. Introduction

Les écosystèmes aquatiques sont le siège d’une vie foisonnante, tant animale que végétale, qui joue un rôle primordial dans le fonctionnement de ces milieux. Parmi les microorganismes peuplant les eaux douces, Pythium est l’un des plus actifs.

Plusieurs études ont rapporté la capacité de ce genre à produire des composés de différentes natures. Les enzymes y occupent une place très importante, tels que les pectinlyases et les cellulases produites par la plupart des Pythium phytopathogènes, notamment P. debaryanum, P. aphanidermatum, P. graminicola, P. intermedium, P. irregulare, P. scleroteichum et P. splendens (BELL et WALKER, 2004; CHEN et al., 1998; GUPTA, 1956; NEMEC, 1974; PLAATS-NITERINK, 1981). D’autres enzymes sont également produites tels que la ceramide aminoethylphosphonate par P. prolatum (WASSEF et HANDRIX, 1976) et l’isocitrate dehydrogenase par P. ultimum (KIM et al., 1996). D’autres composés comme les phytotoxines ont été isolés à partir de plusieurs espèces. Notons, à titre d’exemple, l’acide indole 3-acétique et le tryptophole produits par P. ultimum et P. Group F (REY et al., 2001). Ajoutons à tout cela plusieurs acides gras d’importance économique considérable produits par P. ultimum et P. irregulare, notamment l’acide eicosapentaénoïque (Oméga 3) et l’acide arachidonique (GANDHI et WEETE, 1991; OBRIEN et al., 1993; STREDANSKY et al., 2000; ZHU, 2002).

La littérature reporte l’analyse de ces métabolites principalement par la Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) (MICHEL, 2001), l’électrophorèse en gel de polyacrylamide contenant du laurylsulfate de sodium (SDS PAGE) (CHEN et al., 1998), la Chromatographie sur Couche Mince (CCM) (WASSEF et HANDRIX, 1976) et autres, cependant très peu d’études ont fait appel à la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (ZHU, 2002).

Se basant surtout ce qui précède, nous nous sommes proposés de faire une étude sur les métabolites volatils de P. diclinum, sachant que ce dernier a été isolé à partir d’une retenue de barrage destinée en grande partie à la production d’eau potable.

2. Matériels et méthodes

2.1 Culture du champignon

Pythium diclinum a été isolé pour la première fois à partir d’une retenue de barrage destinée en grande partie à la production d’eau potable. Il a été cultivé dans deux milieux liquides différents : un milieu riche, PYG (Peptone Yeast Glucose) (FULLER et JAWORSKI, 1987) et un milieu pauvre, PCB (Potato Carrot Broth) (PLAATS-NITERINK, 1981).

500 mL de chacun des deux milieux sont inoculés avec huit rondelles de 5 mm de diamètre (ZHU, 2002) prélevées d’une jeune colonie de l’espèce à tester. Des milieux non inoculés servent de témoins. Les cultures liquides sont incubées sous agitation à 90 tours par minute et une température de 25 ± 1°C.

Après 20 jours d’incubation, les cultures sont passées à travers des filtres de verre fritté de porosité n° 2. Les filtrats bruts ainsi obtenus sont ensuite soumis à l’extraction.

2.2 Extraction

L’extraction a été faite avec deux solvants organiques, le chloroforme et l’acétate d’éthyle, dans le but d’extraire le plus grand nombre de composés (EL AISSAMI et al., 1999).

Un volume de 500 mL de chacun des filtrats est traité trois fois de suite par 500 mL du solvant. Les trois phases organiques recueillies sont évaporées à sec à 40 °C à l’aide d’un évaporateur rotatif. L’extrait obtenu est repris ensuite dans 1 mL du solvant.

2.3 Analyse des extraits de Pythium par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-SM):

Les extraits sont analysés par chromatographie en phase gazeuse à l’aide d’un appareil de type HP 6890 équipé d’une colonne capillaire modèle HP-5MS (5 % Phenyl Methyl Siloxane).

La température du four étant programmée comme suit : 2 minutes à 80 °C suivies d’une première montée jusqu’à 180 °C à raison de 10 °C•min-1, stabilisation à cette température pendant 2 min puis d’une deuxième montée jusqu’à 250 °C à raison de 5 °C•min-1. L’injecteur est porté à une température fixe de 260 °C. Le volume injecté est de 1 µL et le gaz vecteur est l’hélium.

L’identification des composés a été réalisée par couplage du chromatographe en phase gazeuse à un spectromètre de masse. L’appareil est couplé à un système informatique gérant trois bibliothèques de spectres de masse : NIST98, HPPEST et PMW_TOX2. Les composés majoritaires ont été comparés à des produits de références.

3. Résultats

3.1 Milieu PYG

L’extrait chloroformique de P. diclinum cultivé sur milieu liquide PYG a montré plusieurs pics majoritaires. L’identification des spectres de masse a montré huit composés dont le plus important est le cyclotétradécane suivi par l’acide myristique. Les six autres composés sont deux acides, un alcool, un aldéhyde et une cétone, leurs abondances sont comprises entre 3,32 % et 9,1 %.

L’extrait d’acétate d’éthyle renferme douze composés de nature différente. Sept des produits détectés sont des hydrocarbures dont un est insaturé. Il y a également trois alcools, un ester et un aldéhyde. Le composé majoritaire est le tridécane suivi du phthalate de diisooctyle et du dodécane avec des abondances respectives de 100 %, 46,76 % et 32,06 %. Les autres composés détectés ont des abondances faibles comprises entre 3,54 % et 18,33 % (Tableau 1).

Tableau 1

Composition chimique des extraits obtenus par les deux solvants (chloroforme et acétate d’éthyle), des filtrats de culture des trois Pythium dans le milieu liquide PYG.

Chemical composition of the extracts obtained by extraction with two solvents (ethyl acetate and chloroform) of the culture filtrates from the three Pythium species grown in liquid PYG medium.

Composition chimique des extraits obtenus par les deux solvants (chloroforme et acétate d’éthyle), des filtrats de culture des trois Pythium dans le milieu liquide PYG.

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3.2 Milieu PCB

L’extrait chloroformique dans le milieu PCB montre peu de composés, il faut noter toutefois que, parmi les composés identifiés, trois sont majoritaires, le phtalate de diisooctyle, le cyclotétradécane et le tétradécane. Le tritétracontane et l’orthoxénol ont également été détectés mais avec de très faibles abondances.

L’analyse de l’extrait d’acétate d’éthyle montre qu’il renferme treize composés. Leurs spectres de masse nous ont permis de les identifier. Six des produits détectés sont des hydrocarbures saturés, dont deux monocycliques, notamment le cyclooctane et le cyclotétradécane qui est le composé majoritaire. Les autres composés sont de natures différentes, trois alcools dont l’abondance varie entre 3,65 % et 10,09 %, un amide (12,81 %), un aldéhyde (7,39 %), un anhydride (6,64 %) et une cétone (3,75 %) (Tableau 2).

Tableau 2

Composition chimique des extraits obtenus par les deux solvants (chloroforme et acétate d’éthyle), des filtrats de culture des trois Pythium dans le milieu liquide PCB.

Chemical composition of the extracts obtained by extraction with two solvents (ethyl acetate and chloroform) of the culture filtrates from the three Pythium species grown in liquid PCB medium.

Composition chimique des extraits obtenus par les deux solvants (chloroforme et acétate d’éthyle), des filtrats de culture des trois Pythium dans le milieu liquide PCB.

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Parmi ces composés, citons le dodécane, le tridécane, le tétradécane, le cyclotétradécane et le phthalate de diisooctyle qui sont détectés aussi bien dans le milieu PYG que dans le milieu PCB (Tableaux 1 et 2). Notons également que quatre de ces métabolites, notamment le tridécane, le cyclotétradécane, le phthalate de diisooctyle et l’acide myristique, sont très abondants.

En comparant les extraits (par le chloroforme et l’acétate d’éthyle) du Pythium cultivé sur milieux PYG et PCB, on remarque que la culture de P. diclinum en milieu PYG présente beaucoup plus de produits. En effet, le nombre des composés secrétés dans ce milieu et extraits par les deux solvants est de 18.

Par ailleurs, en comparant l’extrait chloroformique et celui de l’acétate d’éthyle dans chacun des deux milieux PYG (Tableau 1) et PCB (Tableau 2), nous constatons que l’extrait chloroformique renferme moins de composés.

4. Discussion et conclusions

L’étude des cultures de P. diclinum, sur milieux liquides PYG et PCB, a permis d’isoler et d’identifier plusieurs composés volatils. Un grand nombre de ces composés est obtenu par extraction à l’acétate d’éthyle, le nombre de composés extraits par le chloroforme étant réduit. Ces résultats concordent avec ceux de EL AISSAMI et al. (1999) qui ont démontré une meilleure extraction des composés volatils de Verticillium alboatrum par l’acétate d’éthyle.

Les métabolites secondaires produits par Pythium spp ont fait l’objet de plusieurs études. Il s’agit le plus souvent d’enzymes hydrolytiques tels que les pectinlyases, les polygalacturonases et les cellulases (CHEN et al., 1998; GUPTA, 1956; NEMEC, 1974) et également des toxines qui contribuent à la pathogenèse de ces espèces comme l’acide indole 3-acétique et le tryptophole (REY et al., 2001). Les méthodes d’analyses utilisées dans ces cas sont principalement la Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC), l’électrophorèse en gel de polyacrylamide contenant du laurylsulfate de sodium (SDS PAGE), la Chromatographie sur Couche Mince (CCM), etc., mais très peu d’études ont fait appel à la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (ZHU, 2002).

Les résultats de la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-SM) des extraits de Pythium nous ont permis de constater sa capacité à sécréter en culture pure un grand nombre de composés volatils.

Parmi les métabolites identifiés, nous citons :

Le 4-hydroxybenzaldéhyde qui a été reporté comme l’un des métabolites secondaires de plusieurs microorganismes phytopathogènes (MICHEL, 2001). Citons à titre d’exemple, Phycomyces blakesleeanus (BARRERO et al., 1996), Streptomyces rimosus (CATLIN et al.,1968), Ophiostoma crassivaginata (AYER et TRIFONOV, 1995) et Ceratocystis clavigera, C. ips, C. huntii (AYER et al.,1986) responsables de la maladie des taches bleues des pins. Citons aussi des champignons impliqués dans la maladie de l’esca (vigne) (POLIART, 2000). Il s’agit de Phaeoacremonium chlamydosporum, P. aleophilum et Fomitiporia punctata. Et également, Ophiostoma novo-ulmi, pathogène de l’orme (MICHEL, 2001).

L’éthyl-2-hexanol et le benzaldéhyde sont des composés polluants des milieux aquatiques et sont responsables d’odeurs dans l’eau potable (AWWA, 1989).

Toutefois, il faut noter que plusieurs des composés identifiés sont d’un grand intérêt économique. Notons comme exemple :

L’acide myristique, composé naturel présent dans les produits laitiers et les graisses animales et végétales. Il est utilisé en cosmétique et en industrie pharmaceutique (MERCK, 1996). Consommé à dose physiologique, l’acide myristique aurait un effet favorable sur le profil lipidique comme le montre une étude réalisée chez le hamster (LOISON et al., 2002). Récemment, il a été également identifié parmi les acides gras responsables des arômes de distillation de l’extrait des prunes (TESEVIC et al., 2005). La production de cet acide gras a été également reportée chez une autre espèce de Pythium : P. irregulare (ZHU, 2002). De même, d’autres acides gras d’une grande importance comme l’acide indole 3-acétique (Oméga 3), l’acide δ-linolénique et l’acide arachidonique ont été également détectés dans les cultures des espèces P. ultimum et P. irregulare (GANDHI et WEETE, 1991; OBRIEN et al., 1993; STINSON et al., 1991; STREDANSKY et al., 2000; ZHU, 2002).

L’acetanilide ou N-phénylacétamide, composé doté de plusieurs propriétés pharmacologiques (analgésique, antipyrétique, etc.) (MERCK, 1996).

Le phényléthanol connu également par le 2-phenylethanol, le β-phenylethanol ou le benzyl carbitol. C’est un antimicrobien, un antiseptique et un désinfectant, il est aussi utilisé comme une essence et un conservateur aromatique dans la pharmaceutique et la parfumerie. ETSCHMANN et al. (2002) et FABRE et al. (1998) ont rapporté que ce métabolite peut être produit par les levures, notamment Kluyveromyces marxianus. De même, il a été identifié parmi les métabolites odoriférants produits par les actinomycètes aquatiques.

Le cyclotétradécane, détecté parmi les métabolites volatils responsables des arômes du distillât des prunes (TESEVIC et al., 2005) et l’acide 2-méthylbutanoique, agent aromatisant qui entre dans la composition de plusieurs produits alimentaires et cosmétiques et également produit naturellement présent dans le café, le cacao, les fraises et les framboises (MERCK, 1996).

Le tridécane secrété également par plusieurs basidiomycètes (FONS et al., 2003), notamment les genres Cantharellus, Craterellus et Hydnum.

Aussi, nous avons remarqué que certains métabolites secrétés sont utilisés comme antimicrobiens comme l’orthoxénol, agent désinfectant et antimicrobien utilisé dans la fabrication de pesticides.

On peut donc conclure de cette étude que plusieurs des métabolites volatils sécrétés par Pythium ont des propriétés odoriférantes, ce qui peut suggérer éventuellement la contribution des Oomycètes à côté des actinomycètes et des cyanobactéries aux problèmes d’odeurs et de goût dans les eaux potables. Nous avons aussi constaté la présence dans les extraits du Pythium d’un composé impliqué dans la pathogenèse de plusieurs microorganismes. Et enfin, cette étude nous a permis de découvrir que Pythium, qui est un agent redoutable pour plusieurs cultures par ses enzymes (CHEN et al., 1998; GUPTA, 1956; NEMEC, 1974) et ses toxines (REY et al., 2001) est capable de produire des composés bénéfiques, utilisés particulièrement en cosmétique et dans les industries pharmaceutique et agro-alimentaire.