Dissection fonctionnelle d’un nouveau régulateur de l’initiation de la réplication du chromosome bactérien Functional dissection of a new regulator of DNA replication initiation in bacteria

Chez tous les organismes vivants, l’initiation de la réplication est une étape centrale du cycle cellulaire. Chez les bactéries, la réplication du chromosome est un processus hautement régulé de telle sorte que chaque origine de réplication n’est initiée qu’une seule fois par cycle cellulaire. Chez la bactérie modèle E. coli, différents mécanismes de contrôle s’exercent sur la protéine initiatrice DnaA [1]. Chez la bactérie à Gram positif B. subtilis, la protéine YabA, premier régulateur potentiel de l’initiation, a été identifiée dans un réseau d’interactions spécifiques généré par double hybride chez la levure, et centré autour de la machinerie de réplication [2]. YabA interagit avec l’initiateur DnaA, et avec DnaN, la sous-unité α de l’ADN polymérase. DnaA, est conservé chez tous les organismes eubactériens. Elle se fixe sur la séquence origine du chromosome (OriC) [3]. DnaN est également présent dans l’ensemble des procaryotes. Il forme un dimère qui encercle l’ADN, maintient un contact entre l’ADN polymérase et sa matrice d’ADN, augmentant ainsi sa processivité [4]. Dans le contexte de ses interactions, la protéine YabA apparaît donc comme un lien fonctionnel entre l’initiation et l’élongation de la réplication. YabA, DnaA et DnaN ont été purifiés in vitro et l’existence des interactions binaires entre YabA/DnaA et YabA/DnaN a été démontrée [5]. Ces trois protéines forment également un complexe tripartite in vitro, en accord avec les observations réalisées chez la levure [2, 5]. Ces résultats ont permis de proposer qu’un tel complexe puisse se former et exercer une fonction dans la cellule de B. subtilis. Cependant, dans le réseau d’interactions, YabA possède trois partenaires supplémentaires qui sont impliqués dans différentes voies métaboliques. YabA interagit avec TlpA et McpA, deux composants du complexe chimiotactique, et avec AcuB, une enzyme du métabolisme de l’acétoïne. Ces observations suggèrent que YabA pourrait assurer d’autres fonctions dans la cellule. Chez B. subtilis, nous avons montré, par des approches de cytométrie de flux et de visualisation des origines par microscopie à épifluorescence, que la délétion du gène yabA se traduisait par une sur-initiation et par une augmentation du contenu en ADN des nucléotides [5]. Ces phénotypes sont caractéristiques d’une perturbation du contrôle de la réplication. En utilisant un dérivé fonctionnel étiqueté par la GFP (green fluorescent protein), nous avons montré que YabA se localisait au centre de la cellule et était associée à la machinerie de réplication durant une grande partie du cycle cellulaire. Cependant, le contexte des interactions multiples de YabA illustre sa nature multifonctionnelle, et ne permet pas d’établir une relation directe entre une interaction en particulier et son activité biologique. L’étude du rôle de yabA dans le contrôle de l’initiation ne peut pas se faire simplement en étudiant le phénotype associé à la délétion du gène qui aboutit à la rupture de toutes ses interactions dans la cellule. Pour aborder cette question, nous avons utilisé une approche de dissection fonctionnelle par la rupture sélective des interactions de YabA. L’approche consiste à isoler des mutations dans YabA qui rompent son interaction avec un partenaire en particulier sans affecter les autres, par un test dérivé du double hybride chez la levure. Les mutations sont ensuite transférées dans B. subtilis, afin d’en étudier les effets sur sa localisation subcellulaire et sur les phénotypes liés à l’asynchronie et la sur-initiation de la réplication. L’identification et la cartographie des mutations d’interaction, correspondant au changement d’un seul acide aminé, mettent en évidence les éléments structuraux de YabA qui sont essentiels pour les interactions (Figure 1B). L’analyse de ces mutations sur la fonction de YabA montre que la perte de son interaction avec DnaA ou …