Brassage du génome par recombinaison en méiose: analyse d’un site d’initiation dans le génome de la souris Genome shuffling by recombination during meiosis: analysis of an initiation site in the mouse genome

La méiose est l’étape de la formation des gamètes qui permet le passage de l’état diploïde à l’état haploïde. Cette division par deux du contenu chromosomique résulte de deux divisions successives sans phase de réplication intermittente. Lors de la première division, dite réductionnelle, les chromosomes homologues (maternels et paternels) se séparent, alors que, lors de la seconde, les chromatides soeurs se séparent. La division réductionnelle requiert l’établissement de connexions entre chromosomes homologues, réalisées par les événements de recombinaison homologues réciproques, appelés crossing-over, et dont la représentation cytologique est le « chiasma » [1] (Figure 1). Ainsi, chez la majorité des eucaryotes, on observe au moins un crossing-over par chromosome, et l’absence de crossing-over (chez certains mutants par exemple) conduit à une altération de la ségrégation réductionnelle et à la stérilité. Outre leur rôle mécanique, ces événements de recombinaison méiotique contribuent à un brassage du génome très important qui résulte en la création de nouvelles combinaisons d’allèles à chaque génération. Chez les mammifères, les facteurs et les mécanismes qui contrôlent la fréquence et la distribution de ces événements sont encore mal connus. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, en revanche, plusieurs aspects du mécanisme de la recombinaison méiotique ont été analysés et plusieurs protéines clés ont été identifiées. Compte tenu de la conservation de ces protéines au cours de l’évolution, les données établies chez la levure servent de référence pour aborder ces questions dans d’autres organismes. Une des propriétés remarquables des crossing-over est leur distribution dans le génome: celle-ci n’est pas aléatoire et des domaines dits « chauds » ou « froids » peuvent être identifiés. Ces variations sont particulièrement bien illustrées par les cartes génétiques récemment publiées chez l’homme [2, 3]. À une résolution supérieure, des « points chauds » de crossing-over ont pu être identifiés dans des régions de quelques kilobases (kb) [4]. Afin d’aborder l’étude de telles régions, nous avons mis au point chez la souris une stratégie d’analyse moléculaire directe de la recombinaison dans les cellules germinales, similaire à celle utilisée par l’équipe d’A.J. Jeffreys chez l’homme [5]. En effet, jusqu’à présent, l’analyse des événements de recombinaison était réalisée par des méthodes génétiques impliquant des protocoles lourds de croisements utilisant un nombre élevé d’animaux. Notre objectif était ainsi d’aborder les questions suivantes [6]: Notre étude a porté sur un « point chaud » identifié par analyse génétique dans le génome de la souris. Cette région, localisée à côté du gène Lmp2 (désormais appelé Psmb9), présente une fréquence de crossing-over de 2 % dans un intervalle de 2 kb, soit 2000 fois plus que la fréquence moyenne du génome (0,5 cM/Mb). Ce « point chaud » n’est actif que dans certains hybrides (ici les hybrides R209 x B10), dont l’un des parents (R209) porte un segment chromosomique autour de Psmb9 dérivé de la sous-espèce Mus musculus molossinus [7]. La stratégie moléculaire consiste à utiliser des oligonucléotides spécifiques de chaque parent pour amplifier par PCR (polymerase chain reaction) de manière sélective les rares molécules recombinantes présentes dans une population de molécules parentales (Figure 2). Cette technique est extrêmement puissante puisqu’elle permet de détecter - mais aussi de quantifier et également de purifier - des événements de recombinaison indépendants, et ce, en principe, sur n’importe quel type cellulaire. Le protocole d’amplification est effectué sur des pools multiples d’ADN génomique dilué de manière à ce qu’une proportion significative de pools ne contienne aucune molécule recombinante. L’analyse de la distribution des pools permet alors le calcul de la fréquence d’après la loi de Poisson. Sur l’ADN de sperme de souris hybrides R209 x B10, la fréquence …